Главная
Коллектив
Научная работа
Публикации
Методики
Сотрудничество
Контакты
21210 / 52166

Наша научная группа выполняет Проект по гранту Российского научного фонда (Соглашение № 17-74-20104 от 01.08.2017 г.) на тему: "Создание биоинженерного биофильма для регенеративной медицины с использованием бактериального альгината".

Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют полимерные эндопротезы для регенерации тканей стенки кишечника. Но до недавнего времени регенеративная медицина желудочно-кишечного тракта (или ЖКТ) развивалась практически без учета воздействия на восстановление тканей того же кишечника бактерий микрофлоры (или правильнее микробиоты), плотно населяющих этот орган. Точнее отношение к бактериям микрофлоры ЖКТ было традиционным – их необходимо было сразу уничтожить, причем, все без различия, потому что довлеющая в медицине парадигма, выработанная в эру антибиотиков, считала все бактерии нашими врагами. И долгое время в силу этой же парадигмы исследования в области хронических воспалительных заболеваний ЖКТ и регенерации его тканей были направлены преимущественно на выявление патогенных свойств бактерий, его населяющих. А успешное применение антибиотиков лишь укрепляло точку зрения, что взаимодействие бактерий с человеком носит, в основном, негативный характер. Должен был произойти существенный переворот в сознании, чтобы бактерии перестали восприниматься исключительно как враги. Однако появление феномена лекарственной устойчивости патогенных бактерий к антибиотикам, а затем быстрое разрастание и усугубление этой проблемы, история успешного применения пробиотиков (т.е. живых «полезных» бактерий) для лечения заболеваний ЖК-тракта и многих других болезней, примеры успешной трансплантации тканей кишечника без их дезинфекции (что обязательно практиковалось раньше), а также развитие молекулярной техники анализа состава микробиоты человека существенно обогатила копилку наших знаний о роли бактерий микробиоты в нашей жизни. Стало очевидным, насколько важны функции микробиоты ЖКТ для здоровья человека. Это «забытый орган», изучение которого теперь требует пристального внимания научной общественности, в частности, требуется другой подход для изучения повреждения и регенерации тканей ЖКТ при различных заболеваниях. Выяснилось, что микробиота критически важна для нормального функционирования иммунной системы, активирует и поддерживает иммунитет, вследствие этого регулирует воспалительные процессы, а нарушение состава микробиоты ЖКТ и кожи, прежде всего, из-за терапии антибиотиками и антибактериальными препаратами, напротив, как раз и могут вызывать различные заболевания. Оказалось, что бактерии нормальной микробиоты способны подавлять рост бактерий, характерных для труднозаживающих ран и язв, активно замещать в поврежденной области патогенные бактерии, и тем самым ускорять процессы регенерации тканей ЖКТ, прежде всего, кишечника и, более того, напрямую способствовать регенерации тканей. Но, к сожалению, исследований терапевтического воздействия пробиотических бактерий на процессы заживления повреждений стенки кишечника, особенно при его протезировании, мало. Это связано, в частности, с недостаточным развитием экспериментальных инструментов и моделей для исследования этой проблемы.

С это целью в данном Проекте мы решили совместить две концепции – разработку экспериментального инструмента для изучения роли пробиотических бактерий для регенерации тканей кишечника и параллельно прототипа медицинского изделия для регенерации тканей кишечника на основе пробиотиков. Т.е. мы создаем химерную (состоящую из живых клеток и биоматериалов) конструкцию для регенерации тканей, где в качестве активного компонента используются не лекарственные вещества и терапевтические белки, как в некоторых медицинских изделиях, и не клетки человека и млекопитающих, как в тканеинженерных конструкциях, а пробиотические бактерии. Но как заставить эти бактерии жить и размножаться в такой искусственной конструкции? И тогда мы обратили свое внимание на те самые патогенные бактерии, с которыми так до сих пор не научились как следует бороться, как раз благодаря наличию у них способности образовывать особую природную конструкцию – т.н. биопленку или биофильм, которая защищает эти бактерии от различных неблагоприятных воздействий, используя окружающие биоматериалы или синтезируя свои собственные полимеры. Примером такой бактерии является Pseudomonas aeruginosa, вызывающая опасное инфекционное поражение эпителия легких, ведущее к фиброзу легких и смерти пациента. Эти бактерии образуют биопленку, используя в качестве связующего вещества синтезируемые ими экзополисахариды альгинаты, образующие гидрогель, которые благодаря своим уникальным свойствам обеспечивают высокую жизнеспособность, а значит и патогенные свойства, а также защищают их от воздействия антибиотиков, чем и вызвана низкая эффективность лечения этого инфекционного заболевания химиотерапией.

Почему бы не использовать этот природный инструмент? Но уже для «полезных» пробиотических бактерий. Так нами была изобретена химерная конструкция, которую мы назвали «биоинженерный биофильм», где в качестве клеток используются пробиотические бактерии, а среду для локального поддержания их жизнеспособности и роста обеспечивает полимерная конструкция особого строения, выполняющая роль локального биореактора, а также модельной системы для исследования действия различных веществ на микроорганизмы, например, антибиотиков. В более частном случае под биоинженерным биофильмом мы понимаем также прототип медицинского изделия, в котором действующей лекарственной основой являются пробиотические бактерии, а полимерная конструкция, в которую они заключены, может обеспечивать локальное поддержание их жизнеспособности и роста не только в модельных условиях in vitro, но и in situ при имплантации этого изделия и протезирования стенки кишечника для регенерации ее повреждений.

С этой целью на первом этапе Проекта мы взяли безвредные почвенные бактерии рода Azotobacter, единственные в природе помимо Pseudomonas spp. способные к синтезу бактериального альгината, отобрали из них наиболее эффективный штамм-продуцент альгинатов A. agile 12, разработали технологию биосинтеза, выделения и очистки этого экзополисахарида и получили альгинаты с заданными свойствами. Исследовали их физико-химические свойства и показали, что полученные бактериальные альгинаты по своим наиболее важным физико-химическим свойствам, таким как термоустойчивость, водопоглощение, кинематическая вязкость, механические свойства превосходят традиционно используемый водорослевый альгинат, что может придать лучшие защитные свойства биоинженерному биофильму на его основе для инкапсулированных в него пробиотических бактерий. Полученные результаты позволяют в качестве одного из «побочных» результатов Проекта в дальнейшем впервые разработать биосинтетический способ промышленного получения бактериального альгината.

Но из одного лишь альгинатного гидрогеля практически невозможно изготовить изделие для протезирования стенки кишечника или закрытия дефектов ткани. Поэтому на этом этапе мы разработали каркасную конструкцию в виде полимерного трубчатого эндопротеза полых органов (в частности, кишки), имеющую слой из пористых полимерных микросфер, которые и были заполнены гидрогелем на основе полученного бактериального альгината. Эта сложная композиционная конструкция и будет служить «домом» для пробиотических бактерий. В качестве материала для каркаса и пористого слоя трубки-эндопротеза был использован поли-3-оксибутират и его сополимер с 3-оксивалератом, это другие биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, получаемые путем биосинтеза бактериями из того же самого рода Azotobacter. Были получены эти полимеры с заданными свойствами, исследованы их физико-химические свойства, исходя из их анализа, были отобраны полимеры для изготовления каркаса конструкции, был разработан дизайн конструкции, разработана многостадийная методика ее изготовления, исследована ее морфология, получены образцы конструкции для создания биоинженерного биофильма. Фактически даже без использования пробиотических бактерий или лекарственных веществ, что планируется на следующем этапе, была разработана конструкция для протезирования кишечника и закрытия дефектов его тканей.

Наконец, на этом этапе была отработана микробиологическая методика культивирования пробиотических бактерий из родов Lactobacillus и Bifidobacterium, для которых известно, что они обладают антагонистической активностью, т.е. способны активно замещать в поврежденной области слизистой бактерии других видов, в т.ч. патогенные. Эти бактерии предполагается использовать в дальнейшем в качестве активно действующих агентов создаваемого биоинженерного биофильма.

Как можно увидеть даже по 1-ому этапу, Проект построен таким образом, чтобы помимо главной цели – создания биоинженерного биофильма, достигались «побочные», но не менее важные задачи на других уровнях: разработка технологии биосинтеза бактериальных альгинатов и изготовление полимерной конструкции для протезирования стенки кишечника и ее регенерации. Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным биоинженерным исследованием с активным применением биомиметического подхода, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы.