|
|
|
| |
|
Грант РНФ № 20-64-47008 от 28 мая 2020 г.
«Исследование способов улучшения пьезоэлектрических свойств биоматериалов на основе полиоксиалканоатов для контролируемого воздействия на живые клетки и ткани»
| |
|
Пьезоэлектрический эффект играет значительную роль в процессе регенерации живых тканей, например, костной ткани. Кроме того, исследование влияния пьезоэлектрического эффекта на клетки и ткани приобретает особую актуальность в связи с бурным развитием биоинженерных направлений, связанных с интеграцией электронных устройств с живыми тканями, прежде всего, с нервной. Совершенно неизученным является и вопрос роли электромагнитных эффектов, которые способны проявлять многие бактерии, для жизнедеятельности бактерий микробиоты и при их взаимодействии с организмом-хозяином. Тогда как многие бактерии способны к биосинтезу природных полиоксиалканоатов, обладающих пьезоэлектрическими свойствами, и наночастиц магнетита, обладающих проводимостью и магнитными свойствами. Существующие в настоящее время пьезоматериалы имеют серьезные недостатки, связанные, в первую очередь, с тем, что они являются небиодеградируемыми и даже токсичными, что может оказывать существенное влияние на механизмы регенерации тканей или поведения клеток. Это обуславливает поиск новых биосовместимых и биодеградируемых материалов с контролируемым в широком диапазоне пьезооткликом, в том числе в случае наличия магнитной компоненты с использованием внешнего магнитного поля.
Целью данного проекта является создание композитных полимерных биоматериалов с улучшенными пьезоэлектрическим откликом для исследования контролируемого воздействия пьезоэлектрического эффекта на рост бактерий и клеток млекопитающих и регенерацию нервной и костной тканей.
На третьем этапе проекта были выполнены исследования по разработке методик исследования влияния пьезоэлектрического эффекта скэффолдов и кондуитов на основе композитов поли-3-оксибутирата (ПОБ) с магнитоактивными наноматериалами (МН): магнетитом Fe3O4 (М) и магнетитом с частично восстановленным оксидом графена (М-rGO) на пробиотические бактерии и клетки млекопитающих, разработке экспериментальных моделей дефекта периферического нерва с использованием кондуита для роста нерва и экспериментальной модели дефекта кости с использованием скэффолдов, а также продолжение исследования биодеградации и биосовместимости скэффолдов и кондуитов. Нами была разработана и интегрирована в ведущиеся экспериментальные исследования по проекту уникальная установка генерации низкочастотного переменного магнитного поля, которая представляет собой столик, вращающийся между четырьмя неодимовыми магнитами, движимый электромотором с высоким крутящим моментом, но очень низкой скоростью вращения вала, который используется для экспозиции товара в витринах магазинов. Поскольку материалы, находящиеся в рабочей зоне установки в близи магнитов не должны искажать магнитное поле, установка выполнена из материалов, относящихся к слабым диамагнетикам. Столик изготовлен из алюминиевой перфорированной формы для выпекания пиццы, а корпус из пластиковых разделочных кухонных досок. В первом варианте установки корпус был сделан из деревянных разделочных досок и шкантов, на которые передавался крутящий момент с мотора с помощью цепной передачи, выполненной из пластиковых деталей детского конструктора. Установка генерирует переменное магнитное поле с частотой 0,67Гц и максимальной индукцией (интенсивностью) около 70 мТс. Вся конструкция (вместе с мотором) довольно компактная, что позволяет помещать ее в CO2-инкубатор и использовать для воздействия магнитного поля на культивируемые клетки в режиме 24/7, устойчива к влажности и повышенной температуре.
Было показано, что при инкубации грамотрицательных бактерий Escherichia coli в переменном магнитном поле адгезия во всех образцах увеличилась в 1,5-2 раза, тогда как на адгезию грамположительных бактерий Lactobacillus fermentum к скэффолдам ПОБ и ПОБ/М-rGO магнитное поле не влияло, а в образцах ПОБ/М, напротив, приводило к снижению адгезии на 26%. При этом это влияние было единообразно на композитных плёнках и скэффолдах. Влияние переменного магнитного поля также проявилось при культивировании мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в присутствии свободных магнитоактивных наноматериалов. Так, при концентрации наночастиц магнетита и его комплекса с rGO 50 мкг/мл и на 4-ый день культивирования проявилась цитотоксичность наночастиц этих МН, которая отсутствовала в условиях без воздействия магнитного поля. Однако цитотоксичность этих наночастиц для клеток нейробластомы SH-SY5Y в магнитном поле не изменилась. Что касается влияния магнитного поля на рост клеток на композитных скэффолдах, то как в случае МСК, так и нейробластомы SH-SY5Y значимого эффекта не наблюдалось. Кроме того, был разработан оригинальный метод 3D-культивирования опухолевых клеток HEp-2 методом магнитной левитации в постоянном магнитном поле с использованием скэффолдов из ПОБ/М и ПОБ/М-rGO как магнитоактивных носителей для клеток.
Помимо установки по генерации низкочастотного переменного магнитного поля на данном этапе провели также разработку кондуитов для регенерации нервов. Нашими коллегами из ТПУ методом электроформования были изготовлены электроформованные кондуиты. Для этого пришлось модифицировать установку по электроформованию, смонтировав на ней вращающийся стальной цилиндрический барабан для осаждения на его поверхности отвердевающих полимерных нитей. В ходе совместной работы были разработаны кондуиты оптимальной конструкции - диаметром 2 мм и с толщиной около 200 мкм. Этот кондуит, изготовленный из композита ПОБ с магнетитом, был использован для разработки экспериментальной модели дефекта периферического нерва. Разработанная нами экспериментальная модель дефекта периферического нерва на крысах представляет собой хирургическую операцию по удалению фрагмента седалищного нерва длиной 10-15 мм и помещению двух образовавшихся концов нерва в канал электроформованного кондуита из композита ПОБ с МН с их фиксацией хирургическими нитями на краях трубки. Была разработана также модель некритического дефекта кости на крысах, которая представляет собой хирургическую операцию по формированию отверстия в бедренной кости крысы диаметром 1,5 мм и помещением в него фрагментов скэффолда из композита ПОБ с МН.
Была исследована тканевая реакция при подкожной имплантации скэффолдов из композитов ПОБ с МН на лабораторных крысах in vivo при использовании гистологических методов. Было показано, что наблюдается примерно одинаковая мягкая тканевая реакция на имплантацию скэффолдов из ПОБ, ПОБ/M и ПОБ/М-rGO. Проведение эксперимента по долговременной биодеградации (на сроках от 1 до 6 месяцев) скэффолдов из композитов ПОБ с МН с использованием разработанных моделей: ферментативной деградации in vitro и биодеградации при имплантации лабораторным крысам in vivo показало, что наибольшее падение массы происходит после 6 мес. ферментативной деградации и наблюдается у скэффолдов из композита ПОБ с М/rGO – более чем на 40%, тогда как у других типов скэффолдов - не более чем на 7%. Наибольшая биодеградация in vivo скэффолдов происходит также через 6 месяцев после подкожной имплантации и наиболее выражена, напротив, у контрольных скэффолдов из ПОБ. Исследования изменения физико-химических свойств в процессе биодеградации проведены нашими коллегами из ТПУ.
Для совместного освоения методик исследования воздействия магнитного поля на рост клеток на скэффолдах, использования высокотехнологичного оборудования в обоих университетах и обсуждения полученных результатов, были проведены долговременные командировки 2-х сотрудников из ТПУ в МГУ и кратковременная командировка руководителя проекта МГУ в ТПУ. В ходе работы в МГУ в течение месяца коллегами из ТПУ при обучении и помощи сотрудников научной группы МГУ была проведена комплексная работа по исследованию роста МСК на скэффолдах и кондуитах в установке по генерации переменного магнитного поля, а также разработка модели дефекта периферического нерва на крысах.
По данному проекту были опубликованы 5 статей, в т.ч. 2 статьи в журналах Q1, написана и отправлена в журнал Q1 еще одна статья, были опубликованы также 3 совместных статьи в журналах Q1 по сопряженному проекту ТПУ.
Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным исследованием, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы.
| |
|
Назад
| |
|
Грант РФФИ (международный, Бел_а) № 20-54-00021 от 24.04.2020 г.
«Создание микроструктурированных плёнок природного поли-3-оксибутирата и исследование их биологической активности на клеточных культурах»
| |
|
Новые клеточные технологии, такие как тканевая инженерия, связаны с культивированием клеток на различных полимерных конструкциях. Поэтому влияние структуры полимерной поверхности на рост и функциональную активность клеток человека является актуальной научной задачей в клеточной биологии и биоинженерии. Этот проект является междисциплинарным и международным, проводится совместно с научным коллективом Института Новых Материалов НАН Белоруссии.
Все больше данных свидетельствуют о том, что поверхность является не только «пассивным» субстратом для прикрепления и роста клеток, но ее нано- и микроструктура способны активно влиять на функционирование клеток, например, изменяя скорость их роста или превращения в другие типы клеток. Соответственно, регулируя нано- и микроструктуру поверхности полимерной подложки, можно контролировать основные физиологические параметры роста и трансформации клеток. В подавляющем большинстве научных работ исследование влияния структуры поверхности на жизнеспособность, перемещение, рост и развитие клеток различных типов проводится при их культивировании на структурированной поверхности с искусственно-сконструированной поверхностью, например, в виде регулярно расположенных столбиков, ямок или в виде полосок. Между тем, нано- и микроструктура природных веществ (прежде всего, полимеров), которые образуют различные поверхности органов млекопитающих (слизистые, внутренние структуры костной и хрящевой ткани, внутренняя поверхность сосудов, внешние поверхности сосудов и нервов) играют большую роль в регуляции передвижения, роста и преобразования различных клеток в организме человека и млекопитающих. В полной мере это относится и к природному полимеру, поли-3-оксибутирату (ПОБ), который является предшественником целого класса биоразлагаемых и биосовместимых полимеров – полиоксиалканоатов, широко используемых в медицине для изготовления имплантируемых медицинских изделий, в фармацевтике для получения новых лекарственных форм, а также для получения конструкций для тканевой инженерии. Будучи структурированным, этот биополимер при получении из него тонких пленок способен образовывать различные микроструктуры на их поверхности, что является замечательным инструментом для создания новых геометрических элементов, способных влиять на рост и развитие клеток, выращиваемых на них, если уметь управлять формированием таких поверхностных структур. Оригинальная методика контролируемого биосинтеза ПОБ и его сополимеров с заданной химической структурой и физико-химическими свойствами, прежде всего, степенью кристалличности и оригинальный метод «самоорганизации» микрокапель воды позволяют биополимеру проявлять присущие ему естественные микроструктуры при одновременной возможности управлять их основными характеристиками (например, линейным размером). Вместе с получением пленок с искусственной структурой поверхности такая комбинированная технология даст возможность выяснить, обладает ли биологической активностью по отношению к культивируемым клеткам полимерная поверхность с регулируемой «естественной» или искусственной структурой.
| |
|
Назад
| |
|
Грант РФФИ № 18-29-09099 от 20.11.2019 г.
«Разработка биоинженерной исследовательской модели для ранней диагностики рака головы и шеи»
| |
|
Аннотация, публикуемая на сайте РФФИ (кратко; описать содержание проведенных исследований и полученные результаты за весь срок реализации Проекта)
В настоящее время, в онкологии активно развивается новое направление по созданию 3D экспериментальных моделей опухолей in vitro для исследования с их использованием новых противоопухолевых препаратов и средств диагностики в качестве альтернативы широко используемых в доклинических исследованиях стандартных методик культивирования опухолевых клеток на культуральном пластике in vitro и моделей опухолей in vivo на лабораторных животных. Это направление особенно актуально для моделирования in vitro опухолей плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ), которые характеризуются ранним метастазированием и быстрым прогрессированием, в связи с чем его относят к исключительно агрессивным и злокачественным опухолям, т.к. используемые ранее 3D-модели, например, сфероидная модель, не учитывают многие характеристики таких видов опухолей. Показано, что рост опухолевых клеток и экспрессия опухолевых маркеров в биоинженерных моделях in vitro значительно отличается от такового у опухолевых клеток, культивируемых в стандартных условиях на плоскости культурального пластика, что приближает их к реальной клинической картине опухолевого роста. Поэтому разработка биоинженерных моделей опухолей с использованием различных биополимерных конструкций (гидрогелей, микросфер, скаффолдов и других) особенно актуально для исследования экспрессии опухолевых маркеров с целью разработки новых средств ранней диагностики опухолевых заболеваний.
Нами разработана комплексная методика выращивания клеток рака гортани человека НЕр-2 на полимерных микросферах двух различных диаметров, на матриксах на основе полимерных микросфер в альгинатном гидрогеле, в альгинатном гидрогеле, а также выращивание из них сфероидов. Для получения сфероидов модели ПРГШ с использованием пористых микросфер были впервые отработаны методы «культивирование на низкоадгезионной поверхности» и «висячая капля». Была отработана методика анализа экспрессии маркеров ПРГШ в культивируемых клетках: Ki67, р16, р53, е-кадгерина, цитокератина. Разработанная методика основана на совместном культивировании опухолевых клеток НЕр-2 с пористыми микросферами из поли-3-оксибутират-со-3-оксивалерата различного диаметра (65 и 220 мкм) на неадгезивной поверхности в условиях постоянного перемешивания и позволяет создать стабильные клеточные сфероиды с клетками, растущими на поверхности пористых биополимерных микросферах и в пространстве между ними. Была разработана также методика сокультивирования опухолевых клеток НЕр-2 и мезенхимальных стволовых клеток. Было показано, что методика «висячая капля» (в отличие от формирования сфероидов «культивирование на низкоадгезионной поверхности») позволяет получать стабильные 3D-модели ПРГШ гетерогенного состава, состоящие из совместно культивируемых клеток Hep-2 и МСК. Кроме того, была отработана методика выращивания МСК в альгинатном гидрогеле.
Использование пористых биополимерных микросфер придает модели роста опухолевых клеток наличие гидрофобной относительно жесткой рельефной поверхности полимерных микросфер, которые еще и выполняют роль спэйсеров, разделяющих единую массу формирующегося сфероида, что может способствовать развитию мультицентричного прототипа опухоли. Технологическая возможность загрузки микросфер различными веществами, играющими важную роль в патогенезе ПРГШ (например, комплекса белков вируса папилломы человека) для их экспонирования клеткам, а также противоопухолевых веществ (например, паклитаксела) с последующим их пролонгированным высвобождением предоставляет дополнительные инструменты для экспериментального моделирования ПРГШ.
Проведено исследование пролиферации клеток рака гортани человека НЕр-2 на различных конструкциях в сравнении с ростом клеток на культуральном пластике в стандартных условиях. Показано, что клетки линии Hep-2 растут на пористых микросферах из ПОБВ в течение 14 дней, при этом интенсивность их пролиферации выше, чем в образцах без микросфер и по сравнению с моделью роста в альгинатном гидрогеле. Клеточные сфероиды из клеток линии НЕр-2 с использованием микросфер из ПОБВ диаметром 65 мкм характеризуются высокой стабильностью и плотными клеточными контактами наружного слоя, тогда как сфероиды с микросферами диаметра 220 мкм стабильными не являются, что показывает важнейшую роль большой кривизны поверхности и размера микросфер, сопоставимого с размерами клеток. Показано также, что клетки линии НЕр-2 и МСК формируют стабильные химерные конструкции на микросферах диаметром 65 мкм. При выращивании опухолевых клеток как НЕр-2, так и МСК в альгинатном гидрогеле и матриксах на основе микросфер из ПОБВ и альгинатного гидрогеля были отмечены ряд методических проблем, связанных с большой сложностью стандартизации и стабилизации процесса культивирования клеток, что препятствует дальнейшему использованию гидрогеля и матрикса на его основе в дальнейшей работе. Экспрессия опухолевых маркеров р16 и р53 в разработанной модели 3D-роста опухолевых клеток соответствует экспрессии этих маркеров клинических образцов ПРГШ, а распределение экспрессии опухолевых маркеров в сфероидах с микросферами более равномерное, чем у сфероидов без микросфер. Было показано, что по своим гистологическим характеристикам и по уровню экспрессии маркеров ПРГШ p16 и p53 химерная конструкция разработанной нами биоинженерной модели ПРГШ с некоторыми допущениями соответствует определенному типу клинически выявленных образцов ПРГШ - орофарингеальной плоскоклеточной ВПЧ+ позитивной карциноме.
Таким образом, разработанная нами методика получения трёхмерных моделей роста опухолевых клеток с использованием биополимерных микросфер и экспериментальная модели опухоли ПРГШ с ее использованием позволяет варьировать активность клеточной пролиферации и структуру получаемого сфероида. Более «рыхлая» структура, лучший рост клеток и измененное распределение экспрессии опухолевых маркеров в сфероидах с полимерными микросферами может свидетельствовать о нарушении «классической» структуры и физиологии сфероида из опухолевых клеток, которая не вполне соответствует структуре и физиологическим особенностям опухоли in vivo, что открывает новые возможности для исследования опухолевого роста in vitro.
Было проведено исследование морфологии, полимерных микросфер различного диаметра, альгинатного гидрогеля и матриксов (на основе полимерных микросфер в альгинатном гидрогеле) в процессе роста в них опухолевых клеток при помощи световой и электронной сканирующей микроскопии и их физико-химических свойств с помощью методов анализа химической структуры, молекулярной массы, физико-термических свойств и механических свойств. Было показано, что происходит сильное ухудшение механических и других физико-химических свойств (падение механической жесткости, ухудшение термической стабильности, резкое снижение водопоглощения) альгинатного гидрогеля и матрикса на основе микросфер и альгинатного гидрогеля в процессе культивирования в них опухолевых клеток. Напротив, микросферы сохраняют свои механические, термофизические свойства и гидрофильность, что согласуется с данными по гидролитической деградации пленок из самих полимеров, из которых они изготовлены.
Была отработана методика исследования морфологии опухолевых клеток при их росте на поверхности с различной топографией, для чего были использованы подложки с заданным рельефом поверхности. Было показано, что морфология нормальных и опухолевых клеток изменяется различным образом в зависимости от того, на какой поверхности они растут: гладкой или с регулярным рельефом, опухолевые клетки оказались более чувствительны к рельефу поверхности.
Была проведена апробация разработанной модели с использованием противоопухолевого лекарственного вещества (широко используемого в клинической практике паклитаксела) для терапии плоскоклеточного рака головы и шеи с использованием методов исследования пролиферации клеток рака гортани человека Hер-2. Было показано, что паклитаксел значительно сильнее подавляет пролиферацию клеток в химерных сфероидах биоинженерной модели ПРГШ, чем в клеточных сфероидах без микросфер, но при этом в значительно меньшей степени, чем в монослое опухолевых клеток, культивированных на стандартном пластике. Это свидетельствует о важной роли фактора структурированной поверхности, на которой могут расти опухолевые клетки при их 3D-культивировании, для моделирования ПРГШ, что ранее в должной мере не учитывалось.
Разработка экспериментальной биоинженерной модели проводится в сравнении с исследованием биопсийного материла, полученного в клинических условиях. Был проведен сбор клинических образцов (биоптат, слюна) и создан кодификатор для точной обработки полученного материала. Было проведено гистологическое исследование со стандартной окраской препаратов собранных дополнительных образцов гематоксилином и эозином, которое позволило выявить 6 типов опухолей этого рака: орофарингеальная плоскоклеточная ВПЧ + позитивная карцинома; орофарингеальная плоскоклеточная ВПЧ негативная карцинома; плоскоклеточная, высокодифференцированная G1 карцинома; орофарингеальная плоскоклеточная ВПЧ негативная карцинома; орофарингеальная плоскоклеточная ВПЧ негативная, G3 низкодифференцированная карцинома; орофарингеальная плоскоклеточная ВПЧ негативная, G2, умереннодифференцированная карцинома. Метод иммунногистохимического анализа (ИГХ) позволил провести сравнительное исследование экспрессии основных молекулярных маркеров ПРГШ: Ki67, р16, р53, е-кадгерина, цитокератина. Определение в опухоли белка р16 методом ИГХ является диагностическим средством определения в опухолевых клетках вируса папилломы человека (ВПЧ), а детекция методом ИГХ позволяет выявлять мутированные формы белка p53, что является маркером ПРГШ. сравнимые результаты экспрессия р16 и р53 в химерных конструкциях биоинженерной модели и в образцах из клинических случаев свидетельствуют в пользу выбранной методики как возможного способа приближения условий in vitro к реальным физиологическим условиям. Так, по своим гистологическим характеристикам и по уровню экспрессии маркеров ПРГШ p16 и p53 химерная конструкция разработанной нами биоинженерной модели ПРГШ с некоторыми допущениями соответствует определенному типу клинически выявленных образцов ПРГШ - орофарингеальной плоскоклеточной ВПЧ+ позитивной карциноме. Таким образом, разработанная нами новая биоинженерная модель ПРГШ более подходит для экспериментального моделирования такого агрессивного и склонного к метастазированию типу опухолевых заболеваний, как ПРГШ.
Проведенная нами научная работа является междисциплинарным исследованием, в котором целый ряд методов, относящихся к различных естественным наукам: микробиологии, полимерной химии, клеточной биологии, биохимии, иммунохимии, гистологии, клинической онкологии не просто механически собраны вместе, а интегрированы друг с другом для решения конкретной задачи – создания и исследования биоинженерной модели ПРГШ при тесном взаимодействии биологов-экспериментаторов и практикующих медиков. По итогам работы опубликованы 2 статьи в высокорейтинговых журналах Polymers (ИФ 4.329, Q1) и Materials Science and Engineering: C (ИФ 7.06, Q1), 2 статьи в российских журналах, а также отправлен в высокорейтинговый журнал Critical Reviews in Oncology/Hematology (ИФ 6.312, Q1) обзор «Bioengineering models of squamous head and neck cancer» и подготовлена для отправки экспериментальная статья «Hybrid spheroids from poly(3-hydroxybutyrate) porous microspheres and HEp-2 cells for tumor modelling» в высокорейтинговый журнал Biomedicines (ИФ 6.081, Q1). Результаты работы представлены на 8-ми российских и международных конференциях.
| |
|
Назад
| |
|
